5-羟甲基胞嘧啶测序新技术并揭示核酸修饰测序新技术的分子机理

近日，北京大学生命科学学院伊成器研究员课题组与合作者在Journal of the American Chemical Society和Angewandte Chemie International Edition分别发表题为“Bisulfite-Free, Nanoscale Analysis of 5-Hydroxymethylcytosine at Single Base Resolution”和“Unnatural cytosine bases recognized as thymines by DNA polymerases via the formation of the Watson‐Crick geometry”的研究论文，首次实现免亚硫酸氢盐（bisulfite free）的5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）全基因组单碱基分辨率测定，并且解析了之前开发的系列核酸修饰测序技术的分子机理。

5hmC是DNA主动去甲基化的中间产物，研究表明5hmC可作为DNA上一种稳定的表观遗传修饰，发挥独立的生物学功能。现有的5hmC全基因组单碱基分辨率测序技术都依赖于亚硫酸氢盐处理，不可避免地带来DNA降解严重的问题，并且测序成本昂贵。伊成器课题组与芝加哥大学化学系何川教授课题组合作，基于5hmC的特异性氧化与化学标记，且标记产物在随后的PCR扩增过程中发生C到T转变的现象，开发了免亚硫酸氢盐的5hmC全基因组单碱基分辨率测序技术（hmC-CATCH）。通过hmC-CATCH，只需纳克级起始量的DNA样品，即可获得人胚胎干细胞基因组的单碱基分辨率5hmC图谱，并且相对先前的方法，测序成本大大降低。研究表明血液中细胞外游离DNA（cfDNA）上的5hmC可作为癌症的生物标记物。将hmC-CATCH应用于人类cfDNA的5hmC测序，首次获得了人类cfDNA的单碱基分辨率图谱，并且通过hmC-CATCH测序结果可以将癌症病人与正常人区分开。

JACS论文图文摘要

除了hmC-CATCH技术外，伊成器课题组与合作者还开发了系列免亚硫酸氢盐的核酸修饰测序技术（Xia et al., Nature Methods 2015； Zhu et al., Cell Stem Cell 2017），这些测序技术都是基于化合物特异性标记5-醛基胞嘧啶（5fC），生成非天然胞嘧啶碱基（M-fC或I-fC），并且这两个碱基在随后的PCR扩增过程中实现C到T转变。M-fC与I-fC在DNA复制过程被DNA聚合酶识别成胸腺嘧啶难以用现有的碱基识别机理解释。伊成器研究组与北京大学化学与分子工程学院高毅勤课题组合作，解析了非天然胞嘧啶碱基与dA/dG在DNA双链上配对的晶体结构和与dATP在DNA聚合酶活性位点配对的晶体结构，结果表明非天然胞嘧啶碱基可以和dA/dATP以Watson-Crick空间构象配对，但是与dG以wobble构象配对。生化活性实验结果表明，非天然胞嘧啶碱基与dATP的配对可能通过DNA聚合酶的“腺嘌呤偏好性（The A-rule）”实现。这项研究揭示了系列免亚硫酸氢盐核酸修饰测序新技术的分子机理，也拓展了DNA聚合酶对于非天然碱基识别机理的认识。

Angew论文图文摘要

北京大学生命科学学院PTN项目博士生曾虎和生命科学联合中心博士生贺博为JACS论文的第一作者，伊成器与何川和芝加哥大学化学系戴庆博士是该论文的共同通讯作者，该研究得到国家自然科学基金、科技部973计划、北大-清华生命科学联合中心和启东基金的资助。曾虎与北大化学学院博士后Manas Mondal、本科生宋汝怿（现在杜克大学攻读博士）为Angew论文的第一作者，伊成器与高毅勤是该论文的共同通讯作者，该研究得到了国家自然科学基金、科技部973计划和北大-清华生命科学联合中心的资助。